实验概要

本实验介绍了动物细胞基因组DNA中小卫星多态性Southern blot检测的原理和操作步骤。掌握核酸杂交检测技术（Southern blotting技术）、核酸探针的标记技术、小卫星DNA多态性检测分析技术（DNA 指纹图谱技术）和化学发光检测技术。

实验原理

Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待检测的核酸分子通过一定的方法转移（电转印、虹吸转印、真空转印）并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素、尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸与特定标记[放射性同位素、地高辛（DIG）、生物素（biotin）等]的核酸探针在一定温度和离子强度下复性（退火），即分子杂交。该技术是1975年英国爱丁堡大学Southern发明的，固命名Southern印迹杂交技术。利用Southern印迹杂交技术可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组中某一基因的定性和定量分析、基因突变分析及限制性长度片段多态性分析（RFLP）。
固相膜核酸分子杂交的主要步骤及原理如下：
1. DNA的变性： DNA变性解链是杂交成功的关键。Southern印迹杂交时DNA在凝胶中变性，变性方法是将凝胶浸在数倍体积的1.5M NaCl和0.5M NaOH中1h然后用数倍体积的1M Tris-HCl (pH8.0)和1.5M NaCl溶液中和1h。DNA受酸、碱、热等处理均能发生变性，但强酸会使核酸降解。一般认为碱变性较好，可避免DNA降解。热变性在要低DNA浓度（100μg/ml）和低盐浓度（0.1M SSC 含15mM NaCl - 1.5mM柠檬酸三钠，pH7.0）下进行。用SSC稀释DNA溶液为50μg/ml，加10M NaOH使最终浓度为0.1M（pH约12.8），室温变性10min，很快置冰盐水中，用10M HCl或5M NaH₂PO₄调pH到7~8（亦可用碱变性后，调至中性，再加热100℃10min），DNA变怀可用OD260增加（约30~40%）来检测，变性DNA沉淀呈雪样，完全失去纤维状沉淀。变性后加入等量冷的12×SSC，冰浴保存。
2. 变性DNA在硝酸纤维素膜上的固定：硝酸纤维素滤膜（孔径0.45μm）先在蒸馏水中充分浸泡，再用6×SSC浸泡30min~2h，凉干。DNA样品转移或加至硝酸纤维素膜上后，先室温干燥4h，然后在80℃真空干燥2h。DNA样品也可以转移或加至尼龙膜（nylon membrane）上，再用高温烘烤或紫外交联的处理固定在尼龙膜上。
3. 预杂交：湿润的滤膜放入可加热封口的塑料袋或杂交管中，按每平方厘米滤膜加0.2ml预热至60℃的预杂交液（6×SSC，0.5% SDS，5×Denhardt液，100μg/ml鲑鱼精DNA）。鲑鱼精DNA需经过剪切和DNA酶消化处理，然后酒精沉淀纯化，调浓度至10mg/ml，用前放100℃水浴中煮沸变性10min，冰水骤冷。若在塑料袋中杂交，尽可能将袋中气泡赶尽，可封口器将袋口封住。将杂交袋浸入68℃水浴保温3~12h。当预杂交液温度升至68℃时，在滤膜表面常会形成小气泡。轻轻晃动袋中液体即可除去这些小气泡，这一点对于保证滤膜表面充分浸润预杂交液很重要。若在杂交管中杂交，只需将杂交管置入核酸杂交炉（箱）内的旋转支架，调解到到一定转速和杂交温度，完成杂交。
4. 杂交：从水浴中取出塑料袋，用剪刀剪开一角，尽可能挤净预杂交液。用吸管或大枪头将杂交液加入袋中，用恰好是足量的液体保持滤膜湿润（50μl/cm²）。溶液的组成是6×SSC，0.01M EDTA，变性的标记核酸探针，5×Denhardt液，0.5%SDS，100μg/ml变性的鲑鱼精DNA。尽可能赶尽气泡后，将塑料袋严密封口，杂交反应在68℃水浴中进行，所需时间视探针和检测靶DNA的性质及探针的比活性等情况而定，一般4~20h。若在杂交管中杂交，只需倾去预杂交液，杂交管内加入含杂交探针的杂交液，继续在核酸杂交炉完成杂交。
5. 洗膜：取出塑料袋，用剪刀剪开，小心取出滤膜，立即浸入盛有2×SSC和0.5%SDS溶液的盘中，室温下漂洗5min。再将滤膜移入2×SSC和0.1%SDS溶液中，室温下洗涤15min（轻轻摇动）。然后将滤膜移入0.1×SSC和0.5%SDS溶液中；68℃轻轻摇动保温2h，更换缓冲液后继续保温30min。洗膜的温度一般应控制在低于Tm值12℃以上。若在杂交管中洗膜，只需倾去杂交液，杂交管内加入相同洗膜液，继续在核酸杂交炉旋转洗膜。
6. 结果显示：固相膜的放射性杂交结果显示有两种方式，一是放射性自显影法，另一种是液闪计数法。前一种方法比较简单，只需将杂交膜与X光片在暗盒中曝光数小时至数天，再显影、定影即可。对于杂交信号较弱的固相膜，用一块增感屏可显著增强曝光强度。固相膜的非放射性杂交检测一般采用化学发光技术。常用的化学发光技术系统有两种，一种是碱性磷酸酶（AP）系统，包括：
   1) Probe DNA-DIG → Anti-DIG-Ab-AP → Chemiluminescent Substrat (CSPD)；
   2) Probe DNA-biotin → Streptavidin-HRP → ECL。

图1 Southern 凝胶转移杂交技术

图2 Southern blot 技术逐步图解

主要试剂

1. 限制性内切酶Hae III：Fermentas Life Sciences
2. 限制性内切酶Hinf I：Fermentas Life Sciences
3. Biotin标记的33.6 和33.15 两种人源小卫星探针。
33.6小卫星探针：
5′- Biotin-AGGGCTGGAGGAGGGCTGGAGGAGGGCTGGAGG-3′
33.15小卫星探针：
5′- Biotin-AGAGGTGGGCAGGTGGAGAGGTGGGCAGGTGGAGAGGTGGGCAGGTGG-3′
4. 5×TBE缓冲液：0.45M Tris-硼酸(borate)，0.01 M EDTA。
5. 6×载样缓冲液：0.25%溴芬蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油
6. 脱嘌呤液：0.25M HCl。
7. 变性液：0.5M NaOH，1.5M NaCl。
8. 尼龙膜（N -nylon membrane）：带正电荷的尼龙膜。Roche
9. 20×SSC：3M NaCl，0.3M 柠檬酸钠（sodium citrate），NaOH 调pH为7.0，高压灭菌，室温保存。
10. 10% SDS：900ml水溶解100g电泳级SDS。加热到68°C并用磁力搅拌器搅拌助溶。若需要，加几滴浓HCl调解pH为7.2，用水定容到1000ml。室温保存，无须灭菌。
11. Denhardt's溶液：0.02%聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP），0.02% 聚糖体400（Ficoll 400），0.02% 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA)。
Denhardt’s溶液可配制成50×储存液，过滤后保存在-20°C。使用时将储存液10倍稀释在杂交缓冲液中。Denhardt's溶液用水配制。50×储存液：1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）， 1% 聚糖体400（Ficoll 400），1% 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA)。
12. 预杂交及杂交液：6×SSC，0.5% SDS，5×Denhardt's溶液，100 μg/ml 变性剪切的鲑鱼精DNA（denatured，sheared salmon sperm DNA）或酵母tRNA。
13. 探针剥离液：0.2M NaOH，0.1% SDS。塑料瓶室温保存。
14. 马莱酸（Maleic Acid）缓冲液：0.1M马莱酸，0.15M NaCl；固体NaOH 调pH至7.5，高压灭菌，室温保存。
15. 室温洗膜液：2×SSC，0.1% SDS。
16. 60°C严谨洗膜液：0.5×SSC，0.1%SDS。
17. 洗膜缓冲液：马莱酸缓冲液加0.3%（v/v）Tween-20。
18. 封闭缓冲液：含5% BSA的马莱酸缓冲液，现配现用。
19. 辣根过氧化物酶（HPR）标记的链亲和素（streptavidin）（HRP-Streptavidin）。
20. HRP-Streptavidin反应液：HRP-Streptavidin 1:5000稀释在洗膜缓冲液中，现配现用。
21. HPR化学发光底物ECL（SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate）：Pierce Biotechnology（Rockford，IL）公司。
22. 显影液：皇冠牌X光胶片显影粉（无锡市服务用品厂）配制。
23. 定影液：皇冠牌X光胶片酸性坚膜定影粉（无锡市服务用品厂）配制。

主要设备

1. 杂交炉：Model 2000 Micro Hybridization Incubator (Robbins Scientific)。
2. 电转印仪：Multiphor II Electrophoresis System NovaBlot Kit (Amersham Biosciences)；
3. X-射线摄影暗匣：规格203mm×254mm（汕头市粤华医疗器械厂）。
4. X-光片：上海申贝办公机械有限公司感光材料厂。

实验材料

采集人静脉血，EDTA 抗凝，提取DNA。

实验步骤

1. 用Hae Ⅲ或Hinf I彻底消化10μg 基因组DNA。

2. 加入9μl的6×载样缓冲液，混匀。
3. 上样于0.8 %的琼脂糖凝胶中(电泳缓冲液为0.5×TBE，胶长20cm) ，在20V （约1V/cm）下电泳至2 kb 以下片段完全出胶时停止(二甲苯青FF带离凝胶阳极端边沿4cm)。

4. 将凝胶在脱嘌呤液中浸泡20 min；室温轻轻晃动，直到溴酚蓝从蓝变黄。
5. 蒸馏水洗涤凝胶1次。
6. 将凝胶在变性液中浸泡30min
7. 将凝胶在0.5×变性液中浸泡20min。
8. 将凝胶用进行Southern 转印（Southern blot）：
   1) 虹吸转印（毛细转印）：
      a. 凝胶小心平推到一块玻璃板上（加样孔超上）；
      b. 裁剪6张与凝胶同样尺寸的滤纸，用0.5×变性液浸湿后平铺在凝胶上，用玻璃棒赶去气泡；滤纸上覆盖一块玻璃板；
      c. 捏住两块玻璃板，翻转后放到实验台面上，再小心揭掉上面的玻璃板。
      d. 裁剪一张与胶同样大小的带正电荷的尼龙膜，用0.5×变性液浸湿后小心平铺在胶表面，用玻璃棒除去凝胶和膜之间的气泡；
      e. 裁剪6张同样尺寸的滤纸，用0.5×变性液浸湿后平铺在尼龙膜上，用玻璃棒赶去气泡；滤纸上平整覆盖5~10cm厚的吸水纸。
      f. 吸水纸顶上加一玻璃板。
      g. 将“吸水纸-滤纸-尼龙膜-凝胶-滤纸”整个转印装置用保鲜膜密封。
      h. 在玻璃板上放一重物（400g）。室温下转印过夜。
   2) 电转印：
      a. 将胶小心平放在干净投影胶片上；
      b. 裁剪一张与胶同样大小的带正电荷的尼龙膜，用0.5×TBE浸湿后小心平铺在胶表面，用玻璃棒除去凝胶和膜之间的气泡；
      c. 裁剪6张同样尺寸的滤纸，用0.5×TBE浸湿后平铺在尼龙膜上，用玻璃棒赶去气泡；
      d. 在胶的另一面同样铺上6层0.5×TBE预先浸湿的滤纸，排除气泡；
      e. 将“滤纸-尼龙膜-凝胶-滤纸”转印装置移入电转印仪中，使尼龙膜面向阳极，凝胶面向阴极（即“阳极←滤纸←尼龙膜←凝胶←滤纸←阴极”），接通电源，室温下，100 mA转印60 min。

图3 毛细管虹吸法Southern转移装置

图4 电转引装置

9. 转印完成后，取出尼龙膜，在2×SSC 中浸泡20 min。
10. 尼龙膜DNA面朝上置于滤纸上，再覆盖一张滤纸，60ºC烤膜30 min。
11. 将尼龙膜DNA面朝上装入杂交管中。
12. 尼龙膜按0.1~0.2 ml/cm² 预杂交液体积60℃预杂交4 h。
13. 33.6 或33.15小卫星探针98℃变性10min，立即放入冰浴中5min。
14. 将探针按预实验确定的信噪比最价浓度加入60℃杂交液中，杂交液按0.05 ml/cm2体积60℃杂交过夜。
15. 尼龙膜用室温2×SSC、0.1% (w/v) SDS 漂洗2×10min
16. 尼龙膜用60 0.5℃×SSC、0.1% (w/v) SDS漂洗2×20min。
17. 对尼龙膜进行化学发光法检测：

注意事项

1. 膜杂交中³²P标记探针与非放射性标记探针的用量分别为5～10ng/ml和25～1000ng/ml。

2. 人DNA用Hinf I 和/或 Sau3A消化，用含有人小卫星的32P-标记的单链DNA探针进行Southern blot杂交，其中人小卫星是由一个共同序列的密切相关的变异体串联重复构成。