实验原理
多聚酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成。
1. 模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
2. 模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
3. 引物的延伸:DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性、退火、延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟, 2~3小时就能将待扩增的目的基因扩增放大几百万倍。
典型的PCR反应体系由如下组分组成:DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热 Taq聚合酶。
除了典型的PCR外,人们还根据各种用途设计了各种不同的PCR。如:
RT-PCR,即在mRNA反转录之后进行的PCR。
反向PCR,常规PCR允许扩增两引物之间的DNA区段,而反向PCR则可以对靶DNA区段之外的两侧未知的DNA序列进行扩增。
不对称PCR,常规PCR使用的引物浓度相同,而不对称PCR使用的引物浓度不同,两种引物浓度相差100倍。在最初20各循环中,主要产物是双链DNA。当低浓度引物被耗尽后,高浓度引物引导的PCR就会产生大量单链DNA,单链DNA可用于序列测定。
主要试剂
1. DNA模板(1ng/μL)(质粒R-pGEX-4T-1,R指代外源基因)
图1 pGEX-4T-1质粒示意图
2. 2.5mmol/LdNTP (TaKaRa)
3. 10×PCR缓冲液(TaKaRa)
4. 25mmol/L MgCl2(TaKaRa)
5. 引物1、引物2(5pmol/μL)
引物序列如下:
引物1:5’-CGGAATTCATGGACGGTCAGA-3’
引物2:5’-GCGTCGACTCATTCAGATTTGCG-3’
6. Taq DNA聚合酶(TaKaRa)
7. 琼指糖
8. 溴化乙锭(1%EB,终浓度0.5μg/mL)
9. DNA marker 2000(TaKaRa)
主要设备
1. PCR热循环仪
2. 琼脂糖凝胶电泳系统
3. UVP凝胶成像系统
4. 移液枪(配套枪头)
5. PCR管
实验步骤
1. PCR反应体系的配制,即在薄壁管内配制25μL反应体系,按下表准确加入各反应物。
反应物
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体积/μL
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10×PCR缓冲液
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2.5
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25mmol/L MgCl2
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1.5
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2.5mmol/LdNTP
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2.0
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引物1
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2.0
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引物2
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2.0
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Taq DNA聚合酶
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0.2
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模板DNA(1ng/μL)
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2.0
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加ddH2O至25μL
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12.8
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2. PCR反应条件的设置,即在PCR热循环仪上设置程序,按程序设置的条件进行扩增。
(1)94℃预变性5min;
(2)94℃变性40s;
(3)55℃退火50s;
(4)72℃延伸50s;
(5)重复步骤(2)~(4)30次;
(6)72℃延伸8min;
(7)12℃ for ever。
3. 1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果(此步骤与PCR扩增产物的割胶纯化一起进行。)
注意事项
PCR的每一个成份是如何影响PCR反应的:
1. 耐热DNA聚合酶
2. PCR反应的缓冲液
3. PCR引物
4. dNTP
5. 模板DNA
6. 温度循环参数
参见附件:PCR的注意事项